《食品科学》：西华师范大学侯怡铃教授等：天

　　落花生，也称花生，学名为Arachis hypogaea，隶属于豆科，一年生草本植物，既属于经济作物，也属于油料作物。花生是我国主要的油料和经济作物，花生叶作为花生副产物，其药用价值成为研究的热点。由于单糖的种类比构成蛋白质的氨基酸种类多，连接的位点也多，故具有多分支结构的花生多糖的结构确定比蛋白质困难得多，因此深入研究花生多糖的一级结构与高级结构对于花生多糖的开发应用具有重要作用。

　　西华师范大学生命科学学院卢睿加、侯怡铃和南充市农业科学院夏友霖等研究通过热水浸提、DEAE-52纤维素分离纯化得到天府花生叶片多糖（AHL-P），利用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振波谱（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等技术对AHL-P进行结构解析，采用CCK-8法探寻其体外免疫活性和抗肿瘤活性，以期为天府花生的开发利用提供科学依据。

　　如图1所示，流动相为蒸馏水时出现了1 个单一对称的洗脱峰，流动相为0.05 mol/L NaCl溶液时出现了1 个较小的洗脱峰，0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液作为流动相的时候没有出现洗脱峰。最终蒸馏水段及0.05 mol/L NaCl溶液段出糖量分别为726.6 mg及222.6 mg，出糖率分别为0.11%和0.034%，本次实验选择出糖量较高的蒸馏水段多糖作为实验对象。

　　如图2A所示，HL-P的HPGPC分析结果显示，在12～16 min处出现单一对称峰，其多分散系数为2.19，提示AHL-P为均一多糖。AHL-P的重均质量（

　　O- 甲基 -1,2,4- 三 -O- 三甲基硅烷 - 木糖，表明木糖是以（ 1 → 2,4 ） - 方式连接。 AHL-P 中的葡萄糖残基碎片离子峰有 3 种，分别为 1,2,3,4,6- 五 -O- 三甲基硅烷 - 葡萄糖、 4,6- 二 - 甲基 -1,2,3- 三 -O- 三甲基硅烷 - 葡萄糖、 6-O- 甲基 -1,2,3,4- 四 -O- 三甲基硅烷 - 葡萄糖，表明葡萄糖以（ 1→2,3,4,6 ） - 、（ 1→2,3,4 ） - 、和（ 1→2,3 ） - 方式连接。 AHL-P 中的阿拉伯糖残基碎片离子峰为 1,2,3,4- 四 -O- 三甲基硅烷 - α - 阿拉伯糖，表明阿拉伯糖是以（ 1→2,3,4 ） - 方式连接。 AHL-P 中的半乳糖残基碎片离子峰为 6- 脱氧 -1,2,3,4- 四 -O- 三甲基硅烷 - 半乳糖，表明半乳糖是以（ 1→2,3,4 ） - 方式连接。由于单糖糖环上的 C2 和 C3 阻力作用，甲基化不易完成，因此葡萄糖残基连接方式为（ 1→4,6 ） - 、（ 1→4 ） - 、和（ 1→ ） - 连接，阿拉伯糖残基连接方式为（ 1→4 ） - 连接，半乳糖残基连接方式为（ 1→4 ） - 连接，木糖残基连接方式为（ 1→4 ） - 连接。

　　以上结果显示，AHL-P由（1→4）-葡萄糖、（1→4）-木糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-半乳糖、和（1→4）-阿拉伯糖组成，葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为7∶2∶1∶1，其中葡萄糖的3 种残基（1→4）-葡萄糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖的物质的量比为3∶2∶2。

　　5.90～4.40为异头氢区，4.30～3.00为环质子区；AHL-P含有6 个异头氢信号，分别是5.29、5.23、5.10、4.96、4.84、4.53，积分比为3∶2∶2∶2∶1∶1，提示AHL-P由6 种不学的单糖残基构成。通常＞5.00为构型的吡喃糖残基的异头氢信号，而＜5.00为构型异头氢信号，因此AHL-P同明包含了构型的吡喃糖和构型的吡喃糖。位于4.40～3.00区域内的信号峰为AHL-P单糖糖环上C2～C6的氢原子信号重叠（图4）。

　　180～0范围中，其中异头碳的范围一般在110～90，AHL-P的 13 C-NMR数据结果显示，在这个范围内一共有6 个共振峰，化学位移为107.49、99.74、99.52、98.57、95.75和91.87。60～85共振区域内为AHL-P单糖残基C2～C6信号位移的重叠信号（图5）。

　　在AHL-P的1H-1HCOSY谱中，异头质子信号的化学位移范围在δ 5.90～4.40和δ 4.30～3.00的信号为单糖残基中的C2～C6的氢信号。AHL-P的1H-1HCOSY谱中，信号A（δ 5.29/δ 3.46）、B（δ 5.23/δ 3.47）、C（δ 5.10/δ 3.42）、D（δ 4.96/δ 4.01）、E（δ 4.84/δ 3.46）和F（δ 4.53/δ 3.15）分别归属于（1→4）-葡萄糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-木糖、（1→4）-半乳糖和（1→4）-阿拉伯糖的H1与H2的耦合信号。同时，根据相邻氢原子的耦合关系，每个单糖残基上的H1～H6的信号位移均被归属（图6、表2）。

　　综上结果显示，AHL-P具有吡喃糖环，由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，其一级结构是以（1→4,6）-葡萄糖和（1→4）-葡萄糖为骨架，（1→4）-木糖、（1→4）-阿拉伯糖和（1→4）-半乳糖为支链，→1）-葡萄糖为末端糖的重复结构单位的多糖（图9）。

　　如图10所示，在1.25～10.00 μg/mL的AHL-P作用下，随着AHL-P质量浓度的增加，S180成团细胞数量减少，并出现部分凋亡细胞。当AHL-P质量浓度为5 μg/mL时，S180率达39.07%，显著高于空白组（

　　如图11所示，在1.25～10.00 μg/mL的AHL-P作用下，随着AHL-P质量浓度的增加，MFC数量减少，并出现细胞间黏附断裂的情况。当AHL-P质量浓度为2.5 μg/mL时，MFC率为52.22%，显著高于空白组（

　　如图12所示，在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，随着AHL-P质量浓度的增加，Raji成团细胞数量及大小均有明显增长。当AHL-P质量浓度为10 μg/mL时，增殖率达104.39%，显著高于空白组（

　　如图13所示，在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，随着AHL-P质量浓度的增加，Jurkat成团细胞数量及大小没有明显变化。与空白组相比，当AHL-P质量浓度为1.25～20.00 μg/mL，Jurkat增殖活性没有显著变化。

　　如图14所示，在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，随着AHL-P质量浓度的增加，RAW 264.7细胞数量明显增多，细胞相互黏附，少量细胞开始伸出伪足。与空白组相比，当AHL-P质量浓度为10 μg/mL时，RAW 264.7增殖率达32.25%（

　　多糖质量在10～500 kDa之间能保持最大生物活性，植物多糖发挥生物活性的质量区间则为1.0～20 kDa，其他质量区间的多糖生物活性则与空间结构有关，质量过大会在一定程度上影响多糖溶解度，不利于与细胞膜上受体结合，质量较小则难以构成活性聚合物结构。本研究分离得到的多糖AHL-P

　　天然多糖作为生物活性大化合物，是由各种中性糖或糖醛酸通过不同糖苷键聚合而成的高化合物，且具有免疫、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性。多糖的构效关系研究发现，多糖主链糖苷键的连接方式不同能造成抗肿瘤和抗病毒活性差异较大，且其具有异质性，高质量和结构的复杂性促进溶液中多糖聚集体的形成，单个的行为和位点，难以分析其构象；同时，多糖在溶液中表现出各种构象，包括单螺旋、三螺旋以及无规则线圈等，这些结构特征均可影响多糖与免疫细胞或肿瘤细胞之间的直接接触，并可能影响由此产生的免疫调控活性和抗肿瘤活性。研究显示，多糖的免疫活性与主链（1→4）-糖苷键具有相关性。从猕猴桃根中提取的

　　-（1→4）-葡聚糖具有明显的免疫活性，能够刺激巨噬细胞表达型一氧化氮合酶（iNOS），iNOS且能催化L-精氨酸和氧产生大量的一氧化氮（NO），从而发挥免疫调节作用。乌头叶中提取的由（1→4）-糖苷键连接的甘葡聚糖表现出较强的补体活性，具有良好的免疫调节作用。库尔勒香梨中提取的多糖主要糖苷键为（1→4）-葡萄糖和（1→2）-木糖，其能刺激巨噬细胞增殖，增加NO及白细胞介素6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌。同明，多糖的侧链多样性也能影响其抗肿瘤活性。紫苏籽多糖PFPS-2中甘露糖、木糖和阿拉伯糖物质的量比为0.28∶0.28∶0.41，其能显著升高白细胞介素2和TNF-α的分泌，显著降低白细胞介素10的分泌，且具有较好的抑瘤活性。刺五加多糖ASPS中阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和甘露糖物质的量比为7.1∶22.3∶7.6∶1.0，其能S180肿瘤细胞生长，显著增高血清中干扰素γ（interferon γ，INF-γ）的分泌。本研究中，AHL-P具有（1→4）-葡萄糖主链，且具有阿拉伯糖残基和木糖残基构成的侧链，符合植物多糖免疫调控和抗肿瘤活性的结构特点。生物活性实验显示，AHL-P体外对Raji和RAW 264.7具有增殖活性，且能S180、MFC的增殖，符合主链上的（1→4）-葡萄糖是其具有良好免疫调控活性的基础，具有的阿拉伯糖残基和木糖残基则是其良好抗肿瘤活性的基础。

　　本实验从天府花生叶片入手，采用热水浸提、醇沉烘干后得粗多糖，经DEAE-52纤维柱层析后，浓缩透析冻干后得到纯化后的AHL-P，HPGPC色谱显示其质量为12.84 kDa，FTIR光谱显示其具有植物多糖典型的红外光谱结构特征，GC-MS测定其单糖成分为葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖，结合NMR图谱鉴定AHL-P是以（1→4,6）-葡萄糖和（1→4）-葡萄糖为主链骨架，（1→4）-木糖、（1→4）-阿拉伯糖和（1→4）-半乳糖作为支链，→1）-葡萄糖为末端糖的重复结构单位的新颖多糖。抗肿瘤活性结果显示当AHL-P的质量浓度为5 μg/mL时对S180的率最高，可达39.07%，在质量浓度为2.5 μg/mL对MFC的率最高，可达52.22%，且AHL-P对MFC效果优于对S180的。免疫活性结果显示，当AHL-P的质量浓度为10 μg/mL时，对Raji和RAW 264.7增殖率可分别达104.39%和32.25%，但对Jurkat没有显著性增殖效果。以上结果为天府花生的应用与开发提供了一定的科学依据。

　　2021年研究生新生学金；2022年三等学校学金；2023年一等省级学金；2023年一等学校学金。

　　丁祥,侯怡铃,卢睿加, 等.“一种天府花生18叶片多糖及其制备方法和应用”. 国家发明专利受理；

　　卢睿加,夏友霖,游宇, 等.天府花生叶多糖AHL-P结构解析及体外抗肿瘤和免疫活性[J/OL]. 食品科学:1-21；

　　王艺学,刘影,赵倪慧,卢睿加, 等.“ 组分析荷叶离褶伞菌多糖LDS-1抗小鼠S180肿瘤的机制.”(录用)。

　　本文《天府花生叶多糖AHL-P结构解析及体外抗肿瘤和免疫活性》来源于《食品科学》2023年44卷第23期45-54页，作者：卢睿加, 夏友霖, 游宇, 王艺学，丁祥，侯怡铃。DOI:10.7506/spkx0421-212。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　为提高我国食品营养与安全科技自主创新和食品科技产业支撑能力，推动食品产业升级，助力‘健康中国’战略，食品科学研究院、中国食品杂志社将与湖北省食品科学技术学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物研究所、中南民族大学、湖北省农业科学院、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室、武汉食品化妆品检验所、国家市场监管重点实验室（食用油质量与安全）、食品学教育部重点实验室共同举办“第五届食品科学与人类健康国际研讨会”。会议时间：2024年 8月 3—4 日，会议地点：中国 湖北 武汉。